独创性声明

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师张焜教授的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。
本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论文成果归广东工业大学所有。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明
指导教师张焜,论文作者签字:徐学涛
2008年5月

第一章 绪论

1.1 研究背景
1.1.1 概述

长期以来，色斑、黑色素沉积一直是困扰人类皮肤的一大问题，也是皮肤病学和美容的重要课题^[1-2]。人体暴露在自然环境中，会受到环境中的物理化学因子的影响，使人体皮肤遭受到有害损伤[31。同时，随着年龄的增长，机体免疫功能和代谢功能都会有所下降，清除自由基的能力也会减弱，皮肤就会变黑，变老^[4-5]。随着生活水平的不断提高，人们对美的追求也就显得尤为迫切,使用化妆品是人们保持皮肤白哲柔嫩的有效手段之一^[6-8]。在所有的化妆品中，美白和抗衰老化妆品最受女性青睐^[9-10]。而在大多数化学制品的化妆品往往会含有一些对人体不利的成分;而且，目前使用的美白添加剂多数由人工合成，也存在化学物质残留的问题，具有毒副作用，长期使用会严重损害消费者的健康和容貌。在注重形象，形象自信的现在，以及随着化妆品“组份天然化”、“回归大自然”的呼声，人们需求的是天然无毒副作用的天然化妆品^[11-12]。这使得天然植物提取物在美白及抗衰老方面的研究引起了人们极大关注。

1.1.2 红缨合耳菊

西藏红缨合耳菊(Synotis erythropappa(Bur.et Franch.)C. Jeffrey et Y.L.Chen)为菊科(Compositae)植物，属西特有植物。产于西藏东南部，西藏当地女性将红缨合耳菊捣碎、烧成灰等后,敷在皮肤表面用于皮肤保养及紫外线防护 。

1.1.3美自化妆品功效评价的主要方法

      黑色素细胞中黑色素合成机制是复杂的，人们对黑色素合成调控的认识经历了酪氨酸酶单酶学说到多酶学说，目前又发现酪氨酸酶呈现多态性^_[13-16]，至今没有定论。从国外文献来看，评价美白化妆品的功效主要以检测施加美白化妆品有效成分后，是否抑制酪氨酸酶活性为主要手段，而酪氨酸酶活性检测方法有放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法^[17-20]

其中以生化酶学法较为简单成熟,酶的材料来源可以从蘑菇中得到的酪氨酸酶，也可以从B16黑色瘤细胞或动物皮肤中得到^[21]细胞生物学培养法，由于黑素瘤细胞具有能够多次传代、生长快和培养条件相对较低等优点，成为筛选美白剂时的首选细胞。20世纪70年代初，Eisinger成功培养出正常黑色素瘤细胞，越来越多地采用人体正常黑色素细胞的体外培养技术。在单细胞基础上建立不同细胞的共培养系统(Co-CultureSystem)，以便在体外重新构建类似于体内细胞间的反应。Regnier等构建的表皮模型用来研究黑色素生成机理，该模型由可以生长并分化的人体角肮细胞组成，暴露在空气中一定时间后可形成致密的角质层，与人体的表皮非常接近。以该表皮模型为基础接种入黑色素瘤细胞和朗氏细胞。该模型中可以清楚地观测到黑色素的产生及其向临近角肮细胞的转移。使用了曲酸后可观测到色素的降低而且黑色素的合成受到了抑制。利用细胞生物学方法可以从多个途径分析黑色素的形成机理^[22]:

1)通过光镜、电镜观察黑色素瘤细胞的存活状况、外部形态及黑色素合成量

2)通过四唑盐比色法(MMT)，测定观察组和对照组吸光度值，根据吸光度值计算细胞增殖指数,观察美白剂对黑色素瘤细胞生长情况的抑制作用。

3)通过化学分析法或免疫学方法对酪氨酸酶活性或含量进行测定，观察美白剂对酪氨酸酶的抑制用用。

4)通过分子生物学方法对黑色素合成过程中相关酶(酪氨酸酶，DHICA氧化酶和多巴色素互变酶)的RNA(信使核糖核酸)、DNA(脱氧核核酸)的表达水平及酪氨酸酶合成量进行测定，以评价美白剂对这些酶的影响。

动物试验法^[23]，采用黄棕色豚鼠10只，均于背部两侧剃毛成若于1cmx2(3)cm大小的去毛区，用棉棒将化妆品依次涂一圈，每日2次，另设去毛皮肤空白区对照。28天后，取豚鼠皮肤活组织进行检查，固定、包埋和切片，对基底细胞中含黑色素颗粒细胞及多巴阳性细胞计数，与去毛皮肤空白区进行对照比较。该方法采用黄棕色豚鼠，其皮肤黑素细胞和黑素小体的分布近似于人类，试验结果重复性好，较小鼠模型更宜用于研究化妆品的美白功能。

(4)人体皮肤试验法^[24-25]，色素沉着的抑制效果试验随机选择皮肤健康的成人前臂内侧2cmx2cm区域为受试部位，一侧为试验区，一侧为对照区。将美白剂涂于人体皮肤上，用皮肤颜色测定仪观察涂敷美白剂前后肤色的变化，评价美白效果。皮肤肤色的测定可使用MEXAMETERMX16黑色素测定仪进行。该种图像分析技术是基于光谱吸收的原理，通过特定波长的光照在人体皮肤上的反射量来确定皮肤中黑色素含量。由于发射光的量一定，就可以计算出皮肤吸收光的量。根据皮肤色度减退程度评价美白剂的功效。

1.1.4 酪氨酸酶

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)又称多酚氧化酶(Tyrosinase)，是一个含铜的多功能糖蛋白，其活性中心有两个铜离子特异性结合位点，两个铜离子之间有一个内源桥基，并且研究发现铜离子与一个位点的结合可以促进其与另一个位点的结合[26-27]。该酶广泛存在于生物体中，是生物合成黑色素的关键酶^[28-29]。黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬腐败的重要表象。哺乳动物体内黑色素分优黑素(Eumelanins)和褐黑素(Phaeomelanins)两种,前一种为棕黑色,后一种为红棕色,两种色素的比例不同造成毛发皮肤颜色的不同.黑素的生物合成是一个出酪氨酸酶催化体内酪氨酸(Tyr)羟化而启动一系列生化反应生成两种黑色素的过程^[30]。这一过程最早为Raper所描述,并由Mason验证并补充，SeoSy^[31]等曾总结酪氨酸酶在催化黑色素形成的作用。黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段(图1-1),第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L-3,4--羟基丙氨酸(L-多巴)(单酚酶活性),并进一步将L-多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的,酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能。第二阶段从多巴醌(DOPAqui2non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程.真黑素生成,多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素,极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素,多巴色素经异构、脱羧生成5,6-二羟基吲哚(DHI)，5,6-二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚-5,6-醌(IndQu);褪黑素生成,多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys-多巴及5-Cys-多巴醒,然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物,最后形成褪黑素.在第二阶段,只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化,大部分反应都是自发的,因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶,第一阶段的两步反应是限速步骤。

图1-1酪氨酸酶催化黑色素形成过程
Fig.1-l Process of tyrosinase to melanin

      一般人类皮肤的颜色很大程度决定于黑色素的生成、移行与分布^[32]。黑色素主要存在于表皮基底层的黑色素细胞内，赋予皮肤颜色。皮肤黑色素细胞组织将黑色素转移到表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，最后随角度化细胞脱落^[33]。若皮肤黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，出现皮肤黑色素^[34]。目前的皮肤美白剂通常是以酪氨酸酶为作用靶点，通过抑制酪氨酸酶活性或者阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径,从而减少黑色素的生成，达到美白皮肤的效果。

1.1.5 自由基.

      皮肤作为人体的一个组织器官,其衰老发生同机体整体的衰老发生的内、外因素有着很大的一致性。但由于它所处的特殊解剖位置,更易受外部环境,包括物理、化学乃至机械等因素的影响,这是皮肤衰老发生的特点所在^[35]。在致皮肤衰老的这些外部因素中,长期受紫外辐射引起的皮肤光性老化是最主要的因素之一^[36]。长期紫外辐射引起的皮肤光性老化的机制是:它使得皮肤中的自出基含量增加，自由基可损害生物膜,促使弹性纤维发生交联与聚合;也促使一-些水解蛋白酶,如弹性蛋白酶、胶原酶从细胞内释放,引起弹性蛋白与胶原降解,它能使皮肤角质化过度,表皮角质层增厚^[37-38]。这些作用使得皮肤变得粗糙,缺乏弹性,松驰,皱纹形成等衰老表现。此外,环境污染造成皮肤损害,促进皮肤衰老也日益受到重视。尤其是汽车排放的废气和吸烟造成的空气污染对皮肤的损害更为普遍。污染的空气含有挥发性有机化合物、- -氧化碳、氧化氮及硫化物等。

      现代科学认为自由基氧化是导致衰老、细胞损伤和退行性变化的主要原因,并受到众多的实验支持^[39-42]。机体内从一开始就时刻在产生着自由基。但同时又具有有效的自由基清除系统，维持体内自由基的正常水平。但是，随着年龄的增长，这种平衡会发生改变。机体内绝大多数分子是由氢原子和其它基团以表示组成的，可以发生与的解离，形成各带一个电子的“R●”与“H●”称为自由基。生物体内常见的自由基有氧离子自由基( .02^2-),羟基自由基(●0H)等。氧离子自由基(●02^2-),羟基自由基(●0H)是最活泼也最具危害性的自由基，它们可与其邻近的任何生物分子反应,在人的皮肤上也逐渐显现出衰老的迹象,因此对产生的自由基的及时清除是延缓衰老最为重要的手段^[43-47]。

      如果化学物能对皮肤细胞具有一定的增殖作用，减少皮肤自由基的生成，提高的活性，就可使皮肤组织更新加快，胶原纤维生成增多，保持皮肤的水分，从而有效地减缓皮肤衰老。天然存在的许多对自由基起作用的物质，有些可作为延缦衰老的良好佐剂。筛选有此类作用的生物和非生物制剂将具有广泛的开发前景。

       因此，检测抗氧化剂对特定活性氧的清除作用，具有重要的意义。

1.2国内外研究现状
1.2.1化妆品美白剂的发展

      东方人希望通过美白护肤品的使用而得到白晰、光洁的皮肤，而欧美消费者主要利用功能性美白化妆品来减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。美白祛斑化妆品市场近年来日趋活跃，销售快速增长。美白剂作为美白化妆品的功能性原.料因此受到极大关注,它的开发与应用研究不断深入，市场上新的功效高、易于配伍的原料不断推出。各国对皮肤美白剂作用机理、新的美白剂的开发和美白剂的应用投入了大量的人力、物力，并取得了明显的进展，已有很多新的美白剂被应用到产品当中。

(1)曲酸及其衍生物，曲酸由葡萄糖或蔗糖在曲酶作用下发酵、提纯而成，其美白机理是抑制酪氨酸酶的活性，同时又能抑制DHICA氧化酶活性，阻断DHI聚合。这是很少的一种能同时抑制多种酶的单--美白剂。因此是非常值得研究的一类美白剂。曲酸由于对光、热及金属离子不稳定，而且皮肤吸收性较差，人们开发了大量的曲酸衍生物来改进它的使用性能。曲酸衍生物美白机理与曲酸相同。曲酸衍生物是从曲酸上的两个羟基入手，一般进行酯化和烷基化。酯化可以形成曲酸的单酯，也可以形成双酯。目前商品化产品中的双酯、曲酸双棕榈酸酯(KAD-15)是最流行的曲酸美白剂。其较曲酸在光、热稳定性.上有很大提高，美白效果更佳，更易被皮肤吸收。人们还发现KAD-15 与氨基葡萄糖衍生物复配后,其美白效果会成倍增长^[48-51]。曲酸双酯中曲酸的异棕榈酸酯，由于其为液体而易于被添于配方中，因此也有一定市场。曲酸单酯中，曲酸单亚麻酸酯结合了曲酸与亚麻酸的双重美白作用，美白效果很好,并且能有效吸收紫外线，但稳定性不如KAD-15^[52]。Sansho seiyaku公司开发了酰氨基脂肪酸曲酸酯,具有较好的酪氨酸酶抑制活性，同时将脂肪酸酰氨基加入化合物中，赋予其润肤和调理作用，为开发曲酸衍生物提供了新思路^[53]。20世纪90年代以来，科研人员开发了许多新的曲酸衍生物，如曲酸苯丙氨酸酶, Vc曲酸酯。N-曲酸-L-苯丙氨酸，显示出极强的美白活性，它的美白机理与曲酸相同，但它ICso值只有 曲酸的1/80，令人瞩目。N-曲酸-L-苯丙氨酸曲酸酯，显示出更强的美白活性，其IC₅₀值只有曲酸的1/380 , 更是值得研究的对象之一^[54]。Vc曲酸酯，是L-抗坏血酸与曲酸在2-位上结合产物。它具有很好的热稳定性和酪氨酸酶抑制活性，同时又具有更强的自由基清除功能。它具有Vc与曲酸的协同作用，是曲酸衍生物中很值得重视的化合物，符合美白剂开发的方向[55]。研究还表明,与曲酸有相似吡喃酮结构的化合物同样表现出良好的美白功效。它们来源于发酵，也可以合成，以它们为 母核进行衍生化是值得探索的事,为我们开发美白剂提供了新的领域。

(2)氢醌及其衍生物，氢醌是传统美白祛斑成分，但由于安全问题, CTFA 2000年版的化妆品成分评审概要中明确指出,禁止氢醌用于驻留性化妆品中，非驻留化妆品用量要小于1%,因此氢醌是不合适作为化妆品的美白剂。熊果苷作为氢醌的重要衍生物，是很流行的美白剂。熊果苷安全性高，美白效果明显，它的应用与研究已相当广泛。熊果苷的来源包括植物提取、植物组织培养、酶法及有机合成。其中合成品由于其纯度高、色泽浅，活性也很高，而在市场上占主导地位。熊果苷美白效果较曲酸及其衍生物有明显差距。在不同研究中表明，熊果苷酪氨酸酶抑制率ICso值为曲酸的2-10倍。为此，人们为进- .步提高熊果苷的功效，开发出很多新衍生物，其中值得关注的是Vc熊果苷磷酸酯(钠).它表现出了Vc熊果苷的协同作用，并具有很好的稳定性^[56]。

(3) Vc及其衍生物，Vc由生物发酵制备得到,是人们心理上极易接受的美白剂。Vc对除去后天性黑色素沉积有明显效果，并且具有抗氧和清除自由基作用。但由于Vc水溶液不稳定和不易被皮肤吸收等缺点,人们开发出的Vc脂肪酸酯和Vc磷酸酯盐可以避免这些缺点。Vc的酯一般是Vc2 ,6位衍生化产物，其稳定性和皮肤吸收性好。其中Vc棕榈酸酯是应用广泛的Vc的脂肪酸酯,它是油溶性,用于化妆品常与其他美白剂复配，从而获得稳定、高效的美白效果。Vc的磷酸酯盐主要有Vc磷酸酯镁和Vc磷酸酯钠。Vc磷酸酯镁的美白效果较Vc磷酸酯钠好,价格也较后者低,在Vc类美白剂市场中占有主导地位。Vc磷酸酯镁商品名MAP SL,比Vc要稳定的多。3%Vc磷酸酯镁在40 C下水溶解，6个月仍保持90%的活性,并且易于配方的开发和皮肤吸收。但Vc磷酸酯镁的水溶液长时间放置会析出沉淀,为改善这一点，科研人员开发新的Vc磷酸酯盐-丙胺基Vc磷酸酯。它的美白效果与Vc磷酸酯镁相当,但它的水中稳定性相当好^[57]。另外一个重要Vc的衍生物是Vc-2-O-a吡喃葡萄糖,它的稳定性很好,易于作配方,但它是发酵法生产,价格昂贵。

(4)果酸类，果酸具有很强的软化角质层,脱去死皮,使皮肤细腻、有光泽。大多数美容产品中都声称含有果酸,它的使用往往与其他美白剂复配。天然果酸中有乳酸、苹果酸、水杨酸及其衍生物,研究表明L-乳酸的酪氨酸酶抑制率优于Vc磷酸酯镁。a型果酸都具有较强的皮肤刺激性,而β型果酸则刺激性小，因此低刺激β型果酸是主要开发的方向。

(5)其他重要的美白剂，尿黑酸又称龙胆酸，是常用的止痛药和治风湿病的药，在化妆品中应用有限。近年来研究表明，它的甲酯和乙酯表现出很高酪氨酸酶抑制活性，IC₅₀值约为曲酸的2倍，值得关注的是在质量浓度超过100μg/mL时，对DHICA氧化酶(TRP-1)有抑制作用^[58]。

(6)动植物提取物，动物胎盘提取物牛胎盘及羊胎盘的提取物在美白化妆品应用中极为广泛,尽管它美白机理还不确定。近年来,由疯牛病肆虐,尽管没有任何证据证明化妆品中的这些动物提取物对使用者健康有不良影响,但心理上的影响是巨大的。同时,由于动物保护组织抗议,-些公司使用动物组织提取物更加谨慎,从而影响到它的发展。

(6)植物提取物，植物提取物的应用,迎合了人们回归自然的意识,有很强的市场号召力,天然美白剂的用量在未來的市场将有所增加。同时我们也看到许多植物提取物有其独特效果,其酪氨酸酶的抑制率优于传统的美白剂。

1.2.2植物源美白剂
由于而植物来源的美白剂迎合人们的安全需求而成为近年来的研究应用上的焦点之一，且随着天然酪氨酸酶抑制剂开发研究，越来越多酪氨酸酶抑制剂从天然植物中分离出来。1999年Kubo^[59]从 番红花(鸢尾科)的新鲜花瓣中提取出的黄酮醇一山萘酚(图1-2),发现其具有竞争性抑制蘑菇酪氨酸及催化L-多巴氧化的活性，其IC₅₀ .值0.23 _mmol/L. Kubo I^[60]等从非洲产的萝摩科植物Mondia whitei (Hook.f.) Skeels和漆树科掌漆树RhusvulgarisMeile中分离出2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(图1-3),其抑制L-多巴氧化的IC₅₀为0.3_mmol/L研究表明为竞争性抑制剂。JonesK^[61]等从芦荟中分离出的芦荟油通过人类黑色素细胞实验表明对酪氨酸酶抑制作用是竞争性的。KangHS等[62]从Phellinuslinteus果实里得到两种酪氨酸酶抑制组分，3, 4-二羟苯甲醛(图1-4) (2), 5-羟甲基-2-糠醛(图1-5)其IC₅₀分别为0.40和90.8_μg/mL,动力学实验表明抑制作用分别为竞争性和非竞争性的。陈桂霞(63]等对可从桑科植物染色桑提取出的桑黄素(图1-6)对蘑菇酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活力的影响和抑制效应的结果表明:桑黄素对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用;导致单酚酶活力和二酚酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC₅₀)分别为0.08和1.02_mmol/L;桑黄素对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶的迟滞时间有明显的延长效应，0.175μM桑黄素使得单酚酶的迟滯时间从24s延长到362s,迟滞时间增加了14倍，酶的稳态活力下降了61.9%;桑黄素对二酚酶的抑制作用表现为竞争性可逆抑制作用。Nerya 等[64]的研究证明甘草黄 酮glabrene和isoliquiritigenin (图1-7) 可以竞争性抑制酪氨酸酶中的单酚酶和二酚酶活性，IC₅₀值分别为3.5 和8.1 _μg/mL。 Jeong CH等^[65]从 Zanthoxylum piperitum的叶子中分离得到栎精(图1-8),栎精有很强的抑制作用,其ICso为3. 8 _μg/mL，动力学研究表明为竞争性抑制。Fu BQ ^[66]等从乌拉尔甘草中分离纯化得到的三种甘草黄酮:异甘草素-葡萄糖芹菜甙(图1-9)、异甘草甙(图1-10所示)和甘草查耳酮甲(图1-11) 对酪氨酸酶单酚酶活性的影响，并得出异甘草素-葡萄糖芹菜甙、异甘草甙和甘草查耳酮甲的1Cso分别为0. 072 _mg/L、0. 038 mg/L和0. 0258 mg/L.Kubo I等^[67]从药用植物马钱科醉鱼草Buddleia coriacea Remy、菊科Gnaphalium cbeirantif olium Lam和棕榈科Scheelea princes (Mart) Karst中分离出几种竞争性酪氨酸酶抑制剂,其中化合物buddlenoidA和buddinoidB的1Cso分别为0.39 和0. 44 _mmol/L。Kanehira T等[68]从safflower 中分离得到的KinobeonA对酪氨酸和酪氨酸酶有抑制作用，研究表明他们的抑制作用为竞争性的。Wu LC等^[69]通过对red koji 提取液的研究表明，为竞争性抑制作用且IC₅₀为5.57 mg/mL。 Lim YH等^[69]从Impatiens balsamina 的花中分离得到Kaempferol, 其对酪氨酸酶的抑制作用ICso为0.042_mg/L， 动力学研究表明为竞争性抑制。ZhangCW等[70]研究了柑橘中nobiletin对酪氨酸酶的抑制作用,IC₅₀为 1.49 _mg/L， 属竞争性抑制，K;为2. 82 _mg/L。 Matsuura R等^[71]对柑橘类香精油的研究发现myrcene (图 1-12)对酪氨酸酶活性抑制K;值为2. 38 _mg/L,动力学研究表明是竞争性抑制。Kubo1等^[72]通过橄榄油对酪氨酸酶的抑制的动力学实验研究其为非竞争性抑制。2003年他们^[73]又通过茴香酸(图1-13)对酪氨酸酶抑制作用的研究，发现茴香酸随着酶功能的改变呈现可逆性的变化，方式为非竞争性抑制，K;值为0. 603 _mg/L。宫霞等^[74]用L-酪氨酸作底物，测定了银杏叶提取物(总黄酮含量为59%)对酪氨酸酶的非竞争性抑制作用，其抑制常数K;为34 _mg/mL，银杏叶提取物浓度为0. 16 _mg/mL时，最大抑制率为52. 8%。Lee等^[75]从Pulsatilla cernua (Thunb1) Bercht1 et Opiz1根中分离到两种物质: 3,4-二羟 基肉桂酸(图1-14) 和4-羟基-3- 甲氧基肉桂酸(图1-15) ，它们对酪氨酸酶都有较强的抑制作用，IC₅₀分别为0.97和0.33_mg/L，且都为非竞争性抑制类型。Piao XL等^[76]从当归根中分离得到9-羟基-4-甲氧基补骨脂素(图1-16)，研究发现ICso为2.0μg/ml,Lineweaver--Burk曲线表明其抑制类型为非竞争性抑制，K;值为10_mg/L。ZhangCW等[7]研究了柑橘中橘皮苷hesperidin对酪氨酸酶的抑制作用，ICso为16. 08 mg/L,属非竞争性抑制，K;为9. 16mg/L。 Matsuura R等[71]对柑橘类香精油的研究发现Citral (图1-17) 和对酪氨酸酶活性抑制K; 值为0.318 mg/L, 动力学研究表明都是非竞争性抑制。龚静[78]等对红景天水提液对酪氨酸酶抑制效果的初步研究表明ICso为3.9mg/mL,红景天水提液对酪氨酸酶表现为非竞争性抑制。龚盛昭^[79]等研究可从牡丹皮中提取的丹皮酚(图1-18)对酪氨酸酶活性的影响，应用Lineweaver-Burk 曲线推导丹皮酚对酪氨酸酶活性的抑制效应及Michaelis-Menten 动力学，导致酪氨酸酶活力下降50%的丹皮酚浓度为0.60mmol/L,丹皮酚对游离酶的抑制常数(K;)和对酶底物络合物的抑制常数(Kis)分别为0.084和0.12mmol/L,从而确定丹皮酚是酪氨酸酶的混合型抑制剂。WangKH等[80]从25种中草药中筛选出Pharbitisnit、Sophorajaponica、Spatholobussuberectus及Morusalba,分别测试了它们的提取液对酪氨酸酶活性的抑制效应ICso分别为24.9、95. 6、83.9及78.3 μg/mL。BaekS 等^[81]从Idesia polycarp分离得到的β-D-吡喃型葡萄糖苷6-hydroxy-2-[[(1-hydroxy-6-oxo-2-cycloliexen- 1-yl)carbonyl]oxy] methy1]pheny1 β-D-glucopyranosid,对酪氨酸酶的抑制作用IC₅₀ 为8 μg/mL. Behera BC等^[82] 调查了不同国家lichenspecies浸泡液对酪氨酸酶的抑制作用,IC₅₀在18.77μg/mL到26. 08 μg/mL之间。Sasaki K等^[83]从Citrus fruit 中分离得到3,'4',5,6,7,8-六甲氧基黄酮(图1-19)， 其ICso为46.2 _mg/L。Kim sj_[84]等 从Sophora flavescens的二氯甲烷萃取部分中分离出sophora flavanone G、kuraridir 及kurarinone. IC₅₀分别为6.6、0.6及6.2_mg/L。MiyazawaM等^[85]对黑米糠提取液的研究表明，乙酸乙酯萃取部分在浓度为0.4mg/mL时对酪氨酸酶的抑制率可达到80.5%.从该部分中分离得到的原儿茶酸甲酯(图1-20) ICso为0.28 μmol/L. Masuda T等^[86]从39中植物中筛选Garciniasubelliptica等对酪氨酸酶有抑制作用的植物，并从Garcinia subelliptica 中提取出(2R,S-5,7,4',5",7",3"， 4"-heptahydroxy flavanone[3-8"] flavone) (图1-21)， 以酪氨酸为底物时ICso为2.5 pmol/L, 而同样比例浓度条件下的曲酸IC₅₀ 为9.1 μmol/L. Ahmad VU等^[87]从Rhododendron collettianum 分离得到的coumarinolignoid 8'-epi-cleomiscosin 及glycoside8-O-beta-D-glucopyranosyl-6-hydroxy-2-methy1-4H- 1-benzopyrane-4-one混合组分对酪氨酸酶抑制作用ICso为1.33 mg/L。 Kim HJ等88)从千草中提取得到两种酪氨酸酶抑制剂Glycyrrhisoflavone及glyasperin C。IC₅₀ 分别为0.13+0. 01 ug/mL及0. 25 + 0. 01 μg/mL. Azhar-ul-Haq等^[89]对Vitex negundo Linn根的甲醇提取液的研究中，分离得到(+)-lyoniresinol-3 alpha-O-beta-D-glucoside,其的ICso为3.21 mg/L. Sabudak T等^[90]对三叶草从分离得到26-diol 、stigmast-5-ene-3-ol及菜油固醇其中26-diol 对酪氨酸酶抑制作用最强为1C₅₀为2.39 mg/L。Jiang CB等[91]研究了26中台湾植物的乙醇提取液，其中Pyracantha koidzumii的提取液对酪氨酸酶抑制作用最强，IC₅₀为54.8μg/mL。HwangJH等^[92]从101中植物中通过酪氨酸酶抑制及B16细胞实验进行筛选，11 种抑制L-多巴氧化，其中Broussonetia kazinoki var. humilis (leaves and stems)、Broussonetia papyrifera (leaves and bark)、 Cornus officinalis (fruit)、Rhus javanica (gallnut)、及Pinus dens flora (leaves)的提取液有很好的抑制酪氨酸酶及L-多巴氧化。在B16细胞实验Acorus gramineus、 Capsella bursa-pastoris、 Morus bombycis、 Perilla frutescens var. crispa. Quercus dentate (bark)、Rhus javanica (gallnut)、Schizopepon bryoniaefolius、及Sophora flavescens 的提取液当浓度50 μg/mL时都有明显的抑制黑色素抑制作用。

1.3立题依据及选题意义

皮肤黑色素细胞组织将黑色素转移到表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，最后随角化细胞脱落。若皮肤黑色素过速增长和分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，出现皮肤黑色素。皮肤内黑色素是由黑色素细胞生成的，其过程是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴和多巴醌，多巴醌再经多巴色素、最终合成黑色素，然后被分泌到周围的角肮细胞中。其中黑色素的形成过程中，酪氨酸酶起了关键酶的作用，黑色素产生的多少与酪氨酸酶的活性有直接的关系。因此，皮肤美白剂就是通过作用于皮肤黑色素生成，代谢过程中，抑制黑色素生成且符合安全规范的物质。西藏红缨合耳菊( Synotis erythropappa (Bur. et Franch.) C. Jeffreyet Y. L. Chen)为菊科( Compositae)植物, 属西藏特有植物。产于西藏东南部，西藏当地女性将红缨合耳菊捣碎、烧成灰等后,敷在皮肤表面用于皮肤保养及紫外线防护。目前，国内还没有关于西藏红缨合耳菊皮肤美白的研究报道。

本文通过研究西藏红缨合耳菊70%乙醇提取物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分及水溶部分对酪氨酸酶的抑制作用，来探讨西藏红缨合耳菊皮肤美白的依据及功效。尽可能扩大西藏红缨合耳菊的临床应用，希望开发出一种高效纯天然的皮肤美白药物，为人类健康作出贡献。

1.4主要研究内容

根据调研及预实验的结果发现红缨合耳菊具有皮肤美白及抗自由基氧化能力，但其美白及抗氧化功效尚不明确。因此本研究在广泛调阅文献的基础上，对红缨合耳菊提取物的各个不同极性段物质进行活性实验，验证各极性段是否具有抗肿瘤活性。

本课题研究的主要内容:
1.通过体外酪氨酸酶实验，测试红缨合耳菊提取物对酪氨酸酶的抑制效果，
通过动力学实验确定其抑制类型;
2.通过对DPPH自由基及氧自由基的清除实验，测试其清除自由基的能力;
3.通过对B16细胞的影响，测试其对细胞增殖率及细胞形态的影响。

1.5课题来源
教育部高校骨干教师资助计划“几种传统抗肿瘤中药验方化学活性成分及其综合作用机理的研究”(教技司[2000]143号) ;广东省自然科学基金项目“几种传统中药新型抗肿瘤活性成分开发研究”(20010064);广东省教育厅“千百十工程”优秀人才培养基金项目“黄药子抗癌有效成分及其配伍效应研究”(020086);广东省教育厅“千百十工程”优秀人才培养基金项目“几种传统中药新型抗肿瘤活性成分开发研究”(020090);省教育厅自然科学研究项目“以半枝莲为主剂的抗肿瘤验方有效成分开发应用研究”(010041)。

未完待续……