由于人口老龄化加剧,肥胖症、糖尿病、心血管疾病增多,压疮发病率也逐年上升[1] 。西药治疗压疮价格昂贵,且有一定的毒副作用[2] ,而中医药治疗压疮有着一定的优势[3] 。象皮生肌膏为湖南中医药大学第一附属医院自制药,可祛腐生肌、抗炎杀菌,治疗压疮临床疗效肯定[4] ,但其作用机制尚不明确。
本课题组前期动物实验发现,象皮生肌膏能促进压疮大鼠转化生长因子 β(TGF-β)、纤维结合蛋白(FN)及碱性成纤维生长因子(BFGF)的表达,加速创面愈合[5-6] 。 多项研究表明,白细胞介素 - 6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子 ( VEGF )、 p38 丝 裂 原 激 活 的 蛋 白 激 酶(p38MAPK)、MAPK 激活蛋白激酶 2(MK2)在创面修复中起关键作用,IL-6、TNF-α 是炎症反应的关键因子,VEGF 促进新生毛细血管生成,p38MAPK、MK2 表达能调控 IL-6、TNF-α 表达,同时也能参与细胞增殖、分化、衰亡、炎症反应等,促进创面愈合[7-9] 。 本实验在前期研究的基础上,深入研究象皮生肌膏对压疮模型大鼠创面愈合率、病理学改变的影响,对p38MAPK、MK2蛋白的表达及其下游炎症因子IL-6、TNF-α、VEGF的干预效应,进一步探讨象皮生肌膏促进压疮创面修复的机制,为临床应用提供依据。
1 实验材料
1.1. 动物 72 只 SPF 级 SD 雄性大鼠,6 ~ 8 周龄,体质量(200±20) g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SYXK(湘):2019-0004,合格证号:NO. 43072722110170725,伦理审查号:ZYFY20210625。 适应性饲养 1 周后进行实验。
1.2. 药物 象皮生肌膏(湖南中医药大学第一附属医院自制剂,批准文号:湘药制字 Z20070276,规格:50 g,成分:象皮粉、当归、生地黄、生石膏、血余炭、炉甘石、醋龟甲)。 湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司,批准文号:国药准字 Z20000004,规格:40 g,成分:黄连、黄柏、黄芩、地龙、罂粟壳)。
1.3. 主要试剂与仪器 IL-6、TNF-α、VEGF 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公 司, 货 号: ML102828、 ML1002859、 L1064294 );p38MAPK、MK2 抗体( Cell Signaling Technology,货号:8690S、3042S);GAPDH 抗体( Proteintech Group,Inc,货号:60004-1-Ig);RIPA 裂解液(碧云天生物技术有限公司,货号:P0013B);BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司,货号:P0012);预染彩色蛋白 Marker(Bio-Platform,货号:BP107);超敏 ECL 化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司,货号:P0018S);PVDF 膜(Merck Millipore,货号:IPVH00010);苏木素-伊红染色液(Wexis 公司,货号:3201321);中性树胶( 上海标本模型厂,货号:20210215);无水乙醇和二甲苯(湖南汇虹公司,货号:20200526、20190705)。 酶标仪(BioTek 公司,货号:ELX800) ;双垂直电泳仪( 北京六一生物科技有限公司,货号:DYCZ-24DN) ;快速转膜仪(金斯瑞生物科技股份有限公司,货号:eBlotTML1) ;化学发光仪(上海勤翔科技有限公司,货号:ClinxChemiScope 6000) ;水平脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司,货号:TS- 8) ;生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司,货号:JK-6) ;台式高速 冷冻离心机 ( Thermo 公司, 货号: FRESCO17) ;盖玻片和载玻片(世泰实验器材有限公司,货号:10212440C、18810W) ;显微镜( Leica 公司,货号:DM2000LED) 。
2 实验方法
2.1. 动物分组及造模 利用 Excel 的 RAND 函数产生 1~72 个的随机数,将 72 只大鼠分为 4 组,即空白组、模型组、湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组,每组各 18 只。 空白组不予造模,仅背部备皮,其余3 组参照文献[10-11] 中的磁铁加压法进行造模。具体操作:1) 禁食、禁水 8 h 后测量体质量( g);2)按 0. 3ml / 100 g 的剂量腹腔注射 10%水合氯醛麻醉;3)用脱毛膏对大鼠左大臀进行备皮,面积至少 5 cm×5 cm,用碘伏对脱毛区进行消毒;4)手术刀沿正中线做一深至肌肉的纵向切口,镊子钝性分离,埋入圆形磁铁(直径 15 mm、厚度 2 mm、通磁量1700 gS)于大鼠左臀部肌肉组织下;5)伤口处外撒青霉素预防感染;6)用外科手术缝线缝合肌肉层、筋膜和皮肤层;7)术后腹腔给予 10%葡萄糖注射液(2. 5 h / 3ml)维持水和电解质平衡;8)体外放置磁铁吸引体内磁铁,对局部肌肉、皮肤产生持续压力;9)加压 2h 后,将体外磁铁拿下,恢复血液灌注0. 5h,此为 1 个循环,连续 3d,每天 5 个循环重复进行;10)模型鉴定:受压部位皮肤变黑变硬,针刺不出血,提示Ⅲ期压疮造模成功;皮肤变硬或变成黑色焦痂,可见骨骼、肌腱或肌肉暴露,提示Ⅳ期压疮造模成功[12] 。成功造Ⅲ期压疮模型30只、Ⅳ期压疮模型24 只,共 54 只。 于第 3、7、14 天每组随机选取 6 只。
2.2. 干预方法 空白组和模型组给予 0. 9%氯化钠注射液冲洗并用无菌纱布覆盖, 其余 2 组用0. 9%氯化钠注射液冲洗后分别用湿润烧伤膏、象皮生肌膏均匀涂敷于压疮部位,药膏厚度为 2 mm 左右,药膏范围大于创缘 2 mm 左右,覆盖于压疮创面上,无菌纱布包扎,4 组均每天上午换药 1 次,连续用药 14 d。
2.3. 观察指标 1) 创 面 愈 合 率: 治 疗 第 3、 7、14 天,在透明纸上描出压疮面积,小方格纸中计算创面愈合率,创面愈合率 = ( 造膜完成压疮面积-未愈合压疮面积) / 造 膜 完 成 压 疮 面 积 × 100%。2)组织病理情况:治疗第 3、7、14 天,从每组随机选取 6 只 大 鼠 取 相 同 部 位 创 缘 组 织, 面 积 约0. 5 cm×0. 5 cm 大小,固定于 10%中性福尔马林缓冲液中,脱水,包埋,石蜡切片,厚度约 5 μm,采用苏木精-伊红( HE) 染色法观察组织病理情况。3)酶联免疫吸附测定(ELISA)检测 IL-6、TNF-α、VEGF 表达:普通干管采腹主动脉血5ml,静置2h后设置 3000 r·min-1,离心10min,吸取上层血清分于 EP 管中,-80℃ 超低温冰箱中待用,按 ELISA试剂盒操作说明书检测。 4) 蛋白质印迹法( WB)检测 p38MAPK、MK2 蛋白表达:提取创面组织蛋白,蛋白质定量试剂盒( BCA 法) 进行蛋白定量处理,根据目的蛋白分子量大小,配制分离胶和 5%浓缩胶,上样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育:用 5%牛血清蛋白-磷酸缓冲液(BSA-PBST) 稀释一抗,4℃ 孵育过夜; 洗 膜: 次日取出 聚 偏二氟乙烯(PVDF) 膜,PBST 洗膜 5 次,每次6 min;二抗孵育:PBST 稀释二抗,室温孵育 60 min;洗膜:PBST洗膜 5 次,每次 6min;增强化学发光法( ECL 法)显影;采用 Image J 进行灰度分析。
2.4. 统计学方法 采用 Excel 和 SPSS 25. 0 对数据进行录入和分析,结果以均数±标准差( x±s)表示。正态分布、方差齐性,多组间比较采用单因素方差分析,2 组间比较采用 LDS 法。 P<0. 05 表示差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1. 各组大鼠创面愈合率比较 与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天创面愈合率均升高(P<0. 05),但两治疗组组间比较,差异无统计学意义(P>0. 05)。 (见表 1)
3.2. 各组大鼠创面 HE 染色结果 治疗第 3、7、14 天,空白组皮肤结构完好,无血管增生,前后无形态学改变;治疗第 3 天,模型组有大量炎性细胞,组织水肿。 湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组与模型组相比,炎性浸润程度均减轻。 治疗第 7 天,模型组炎性细胞浸润仍明显,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组与模型组相比,可见纤维细胞增殖、血管新生。 治疗第 14 天,模型组可见少量毛细血管,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组可见大量成纤维细胞,毛细血管丰富。 (见图 1)
3.3. 各组大鼠血清 IL-6 水平比较 与空白组比较,模型组、湿润烧伤膏组治疗第 3、7、14 天及象皮生肌膏组治疗第 3 天 IL-6 含量均升高(P<0. 05);与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天 IL-6 含量均下降(P<0. 05)。 与湿润烧伤膏组比较,象皮生肌膏组治疗第7、14天IL-6含量下降更明显(P<05)。(见表2)
3.4. 各组大鼠血清 TNF-α 水平比较 与空白组比较,模型组、湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天 TNF-α 含量均升高(P<0. 05);与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天TNF-α 含量均下降(P<0. 05);与湿润烧伤膏组比较,象皮生肌膏组治疗第 7 天 TNF-α 含量下降更明显(P<0. 05)。 (见表 3)
3.5. 各组大鼠血清 VEGF 水平比较 与空白组比较,模型组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天及湿润烧伤膏组第 3、14 天 VEGF 含量均降低(P<0. 05);与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天 VEGF 含量均升高(P<0. 05)。 与湿润烧伤膏组比较,象皮生肌膏组治疗第 7 天 VEGF 含量升高更明显(P<0. 05)。 (见表 4)
3.6. 各组大鼠创面 p38MAPK 蛋白比较 与空白组比较,模型组、湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、 7、 14 天 p38MAPK 蛋 白 水 平 均 升 高 ( P <0. 05);与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14 天 p38MAPK 蛋白含量均下降(P<0. 05);湿润烧伤膏组和象皮生肌膏组比较,差异无统计学意义(P>0. 05)。(见表5、图2)
3.7. 各组大鼠创面MK2蛋白比较 与空白组比较,模型组、湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第3、7、14 天 MK2 蛋白水平均升高(P<05);与模型组比较,湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组治疗第 3、7、14天MK2 蛋白含量均下降(P<05);湿润烧伤膏组、象皮生肌膏组比较,差异无统计学意义( P>0. 05)。 (见表 6、图 2)
4 讨论
压疮是临床一种常见并发症,易引起伤口感染,甚至导致败血症,威胁生命,其治疗和护理一直是临床一大难题。 本病属于中医学“席疮” “褥疮”的范畴。 外治压疮良方象皮生肌膏,出自《疡科纲要》,以象皮为君药,当归为臣药,生地黄、血余炭、炉甘石、生石膏等为佐使药[13] 。象皮止血、敛疮,且含有钙、铁、铝、锌、磷等微量元素,能有效修复创面[14] ,促进组织细胞生长;当归补血活血、消肿生肌;生地黄生津滋阴、清热凉血;血余炭消瘀止血,炉甘石、石膏清热解毒、止痒敛疮,合用凉血、止痛、生肌。 研究显示,象皮生肌膏治疗压疮疗效确切,祛腐生肌效果明显, 能缩短压疮创面修复的时间[4-6,15] 。
压疮创面修复一般需要 3 个阶段:渗出(炎症反应)、增殖、再生[16] 。 在渗出阶段,血管通透性增加、组织水肿、出现局部炎症反应,以到达稀释毒素和抗炎的作用;在增殖阶段,毛细血管和成纤维细胞增殖修复创面;在再生阶段,创面上皮化再生。研究表明,过度炎症反应可能是压疮创面难愈合的一个关键因素,IL-6、TNF-α 等促炎因子的持续释放,导致创面大量炎性细胞浸润,破坏酶产生,进而促使生长因子降解,抑制毛细血管和成纤维细胞增殖,创面 经 久 不 愈[17]。 如果通过药物干预减少IL-6、TNF-α 水平,这将对压疮创面修复有重要意义。 相关研究发现,八珍汤促进压疮愈合是通过MAPK 炎症通路来调节 IL - 6、 TNF - α 水 平[3] 。p38MAPK 作为 MAPK 家族中的重要成员[18] ,与细胞生长、发育、细胞间功能同步、调节炎症和应激反应密切相关。 p38MAPK 在受到 TNF-α、IL-6 等刺激时,由于蛋白激酶级联反应,p38MAPK 被磷酸化激活,磷酸化的 p38MAPK 进入细胞核内或转移至其他部位,一定程度上影响细胞凋亡、炎症反应的调控,促进单核巨噬细胞产生 IL-6、TNF-α 等炎性因子,使机体炎症反应加剧。 MK2 作为 p38MAPK的作用底物之一[19] ,可被 p38MAPK 磷酸化,通过调控炎症因子、细胞生长、迁移因子等的表达,调控这些因子的稳定性、运输和翻译等。 唐乾利等[20]发现,皮肤再生医疗技术可抑制 p38MAPK 信号通路过度活化,抑制 p38MAPK、MK2 蛋白过度表达,阻断部分信号转导, 从而减少 下 游 底 物 炎 症 因 子IL-6、TNF-α 的释放,这与本研究部分结果一致。VEGF 是参与创面修复重要的促血管生长因子[21] ,特异性作用于血管内皮细胞使其分裂、增生、迁移,促进微血管再生;也可增加血管壁通透性,血浆蛋白易外渗到细胞外基质中,为毛细血管和基质细胞的生长提供营养[22] 。 研究证实,血管新生的过程涉及复杂的信号转导,p38MAPK是调控多种细胞因子表达的上游信号分子,外界刺激引起p38MAPK活化后,能够启动下游 NF-κB 转位进入细胞核,入核的 NF-κB 识别并结合 VEGF 基因的启动子区域,进而增加 VEGF 的表达[23] 。 相关研究显示,象皮生肌膏、湿润烧伤膏对p38MAPK和MK2 蛋白具有抑制作用[20] ,这与本研究结果一致。
本研究发现,象皮生肌膏的创面愈合率优于模型组,表明象皮生肌膏可加速压疮的愈合。 压疮创面有大量炎症细胞聚集,经湿润烧伤膏、象皮生肌膏治疗后炎性细胞浸润程度减轻,可见成纤维细胞和毛细血管增殖。 在治疗第 3、7、14 天分别检测血清 IL - 6、 TNF - α、 VEGF 因 子 和 创 面 组 织 中p38MAPK、MK2 蛋白的表达,发现模型组创面组织中的 IL-6、TNF-α 含量较空白组升高,提示压疮创面有炎症细胞聚焦,其炎症反应处于过激状态;湿润烧伤膏组和象皮生肌膏组的 IL-6、TNF-α 含量均低于模型组,两治疗组的IL-6、TNF-α 含量呈下降趋势,表明象皮生肌膏和湿润烧伤膏能降低压疮创面 IL-6、TNF-α 水平,减轻局部炎症反应。 同时也发现湿润烧伤膏组和象皮生肌膏组的 VEGF 含量高于模型组,两治疗组的 VEGF 含量先升后降,且总体呈上升趋势,这可能与增加创面组织中VEGF 含量,促进毛细血管新生有关。 湿润烧伤膏组和象皮生肌膏组的 p38MAPK、MK2 蛋白均低于模型组,呈下降趋势,提示象皮生肌膏能下调 p38MAPK、MK2蛋白水平,改善其过度表达的病理状态,调控炎症因子,减少IL-6、TNF-α的过度释放以减轻炎症反应。 同时也可调控 VEGF 水平以促进成纤维细胞和毛细血管的合理增生,直接和间接参与压疮创面愈合。
综上所述,象皮生肌膏可以促使压疮创面修复加快,其作用机制可能是通过下调p38MAPK、MK2蛋白,降低IL-6、TNF-α水平和调控VEGF表达来减轻局部炎症反应,促进毛细血管新生,但是还可进一步深入信号通路、基因等层面研究有关机制。
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