3.1 前言
皮肤黑色素形成机理:存在于黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基哚等中间体逐步转化为真黑色素，进而黑色素细胞组织将黑色素转移到表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，最后随角质化细胞脱落。但是由于受紫外线、遗传、内分泌、炎症介质、饮食不当等因素的影响，黑色素代谢异常，皮肤黑素过快增长和分布不均，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，表现为黄褐斑、雀斑和炎症后色素沉着等。从国外文献来看，评价美白化妆品的功效主要以检测施加美白化妆品有效成分后，是否抑制酪氨酸酶活性为主要手段。目前，随着人们对祛斑美白药物需求的不断增加，越来越多的治疗色素沉着性疾病的药物投人到临床使用，其中不少药物确有良效，但使用中也出现了大量的不良反应导致严重的后果。

而将药物直接加入到细胞中观察药物对细胞的影响，则是一种最为直接的手段。由于黑素瘤细胞具有能够多次传代、生长快和培养条件相对较低等优点，成为筛选美白剂时的首选细胞。20世纪70年代初，Eisinger成功培养出正常黑色素瘤细胞，越来越多地采用人体正常黑色素细胞的体外培养技术。为此，我们基于实验室黑色素细胞培养，选用国内外常用B16黑素瘤细胞作为受试细胞，对红缨合耳菊的疗效和安全性的评价，为临床提供资料。

3.2材料与仪器

3.2.1 材料

红缨合耳菊提取物  自制

RPMI-1640培养基  美国 HyClone 公司

小牛血清  美国 HyClone 公司

胰蛋白酶  美国 HyClone 公司

L-多巴  美国 Sigma公司

Triton X-100  美国 Sigma公司

磷酸氢二钠  广州市化学试剂有限公司

磷酸二氢钾  广州市化学试剂有限公司

氯化钠  广州市化学试剂有限公司

氯化钾  广州市化学试剂有限公司

二甲基亚砜  广州市化学试剂有限公司

熊果苷  美国 Sigma公司

3.2.2 仪器

CJT-12超净工作台   北京昌平长城空气净化公司

DG-5031型酶联免疫检测仪  杭州博特仪器有限公司

CH2-TKC-3倒置显微镜  广东光学仪器有限公司

HZQ-F全温振荡培养  上海苏坤仪器有限公司

灭菌锅  上海苏坤仪器有限公司

3.3 实验方法

3.3.1细胞的培养及接种

无菌条件下,将B16细胞接种于含10%(体积分数)的小牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶中,在5%(体积分数)COz培养箱中培养,每3d用0.25%胰酶消化传代一次。待细胞生长到对数期,用PBS洗涤,0.25%酶消化,细胞计数板计数。电镜观察细胞形态变化。调整细胞5X10个/mL。接种于96孔板中,每孔100L,置孵箱中孵育24h后,弃上清液,添加待测药物,每组药物最终质量浓度分别为320mg/L、160 mg/L、80 mg/L、40 mg/L、20 mg儿、10 mg/L、5 mg/L。每一浓度设5个孔,对照组不加药物,代之同量维持液,空白孔不接种细胞。37℃5%的CO,孵箱中孵育 72 h。
3.3.2 倒置显微镜观察

收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔2ml。培养过夜后，加入不同浓度的药液100L，对照组加入同体积的RPMI-1640液。作用不同的时间后，置倒置显微镜下观察，照相并记录实验结果。

3.3.3黑色素细胞增殖抑制率测定

四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法):药物作用72h后，每孔加入5g/LMTT溶液10μL，4h后弃上清液,每孔加入 DMSO 100μL，振荡 10min 左右，在酶标仪上检测各孔吸光度值，以空白孔调零，波长为490nm。

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 显微镜观察

将红缨合耳菊各部分加入培养液(终浓度为320g/mL)，作用于细胞后，我们发现细胞的形态明显发生变化。对照组细胞生长良好(见图3-1);加入EAF部分后，细胞树突减，细胞个数减少，变大(见图3-2);加入nBF部分后发现细胞未发生明显的变化，生长良好(见图3-3):加入WF部分后细胞生长状态稍差，不如对照组及nBF部分组(见图3-4):加入熊果苷组后能明显看到细胞树减少，细胞融合在一起(见图3-5)。

3.4.2 黑色素细胞增值率

红缨合耳菊可抑制黑色素细胞的生长，其效果与浓度相关，随着浓度的增加对细胞生长的抑制能力增加，320g/mL的熊果苷、EAF部分、nBF部分、WF部分对细胞生长的抑制率分别可达到42.57%、65.67%、10.24%、9.75%(表 3-1)。

实验结果表明，受试物对黑色素细胞的毒性作用大小依次是:乙酸乙酯萃取部分>熊果苷>正丁醇萃取部分>水溶部分。熊果苷是常用的化妆品美白添加剂，其美白作用明显，人们对其美白作用的重视超过了对其细胞毒性的关注。然而许多研究均已表明熊果苷具有比较强的细胞毒性。我们的实验结果也对其进行了验证，当浓度为320μg/mL时，对细胞增殖的抑制作用可达到42.57%，可见其毒性较高。红缨合耳菊提取物的测试结果表明乙酸乙酯萃取部分对细胞的毒性比较大，而正丁醇萃取部分及水溶部分则对黑色素细胞的增殖抑制作用较小，浓度在320μg/mL时，其对细胞增殖的抑制率在10%左右，即这两部分有很小的细胞毒性。因此从健康方面考虑，在研究开发美白化妆品添加剂时，若使用熊果苷之类具有细胞毒性的物质，一定要在安全剂量范围内使用，而红缨合耳菊的正丁醇及水溶部分则可作为一种新型的天然植物提取物，基本没有剂量方面的限制。

3.5 本章小结

1.通过对细胞形态的观察，我们发现加入红缨合耳菊提取物及熊果苷后，细胞形态均发生变化，其中以EAF部分对细胞的影响最大。

2.测试了红缨合耳菊提取物对细胞生长的抑制率，研究发现，EAF部分对细胞的致死率最大，在320μg/mL时可达到65.67%，而nBF、WF部分分别为10.24、9.

未完待续……